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酵母双(单)杂交cDNA文库构建服务|实验技术服务

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酵母双(单)杂交cDNA文库构建服务|实验技术服务——pCzn1质粒+Arctic Express宿主菌低温表达体系。
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测序实验流程：
原理
酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能，即以功能未知的新基因去筛选文库。
ProQuest系统依靠报告基因的转录激活来鉴定蛋白相互作用。将一个基因克隆到'诱饵'载体，pDEST32，并和GAL4蛋白的DNA结合域（DBD）表达为融合蛋白。将**个基因或者编码可能的相互作用子蛋白的cDNA文库克隆到'猎物'载体，pDEST22，同GAL4的转录激活域（AD）表达为融合蛋白。当两个蛋白相互作用时，AD和DBD间距离被拉近，从而激活报告基因的表达
服务流程
1) 提取总RNA，分离mRNA，反转录cDNA。
2) 将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应，重组产物转化DH10B感受态细胞。
3) 甘油保存大肠杆菌文库。
4) 提取大肠杆菌文库质粒DNA，制备酵母感受态细胞
5) 大肠杆菌文库质粒DNA转化酵母菌，测定转化效率，
6) 收集酵母转化子，测定文库效价。
7) 甘油保存酵母菌文库。
使用优点：在拥有相关组织基因文库的情况下
1 ）可以用来比对病变组织更快的找到突变基因或者导致变异的蛋白，更快的找到攻克方向。
2 ）可以用作大规模的蛋白筛选，在较短时间内对找到某些药物对相关组织主要的作用蛋白，对于药物的修饰和改进明确方向。
3 ）可以反复使用，培养时间短，适合大规模筛选使用。
4 ）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
5 ）检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
注意事项
1. RNA 的提取（例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定）。
2. 要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。
3. 由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备上等 RNA 很重要。
4. 文库构建要选择合适的载体，常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。
5. 胶回收前电泳槽，电泳板，梳子等都要用1%的HCl浸泡。
6. 胶回收时电压要稳定。
cDNA构建成功关键因素
1. 保证获得数量足够的高质量的起始RNA
2. 反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键
3. 层析柱cDNA分级很关键

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