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基因组文库(Genomic Library)构建技术服务|实验技术服务

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测序实验流程：
基因组DNA文库包括了基因组所有顺序的随机克隆片段。一个好的基因组DNA文库的大小应足够大，以便包括所有的基因DNA顺序。DNA克隆片段也应足够大，其中包括整个基因、连接基因及它们稳定形式所要的侧翼顺序。为了获得高的克隆效率和较大的插入片段，λ噬菌体载体和质粒经常被使用构建基因组DNA文库。λ噬菌体文库易于操作，噬菌体载体上有多克隆位点。λ噬菌体能容纳10-50kb插入DNA，载体类型应根据所要基因组DNA的大小和用途来选择。
构建一个基因组DNA文库的基本步骤：
①分离纯化基因组DNA；
②切割DNA成合适大小的片段以用于克隆；
③载体DNA的制备；
④把基因组DNA段和载DNA连接；
⑤包装重组分子；
⑥测定入噬菌体滴度；
⑦扩增DNA文库；
⑧评估文的质量。
基因组文库构建步骤：1、载体：
l噬菌体：48.5kb,插入型(*多可容纳9kb)、取代型(可容纳 38-51kb，*适19-20kb)， EMBL, Charon 粘性质粒(Cosmid)：4-6kb, 质粒+噬菌体的性质，可容纳大片段的外源基因，*多可容纳46kb。酵母人工染色体克隆体系（YAC，Yeast Artificial Chromosome Cloning System）插入大小200—1000kb 2、载体DNA的制备：高分子量的外源DNA 100-150kb载体DNA酶切反应-----载体臂的纯化-----载体脱磷处理 www.cqwestern.com（常用BamHI）（蔗糖密度梯度离心）（碱性磷酸酶） 3、连接和包装：外源片段与两臂之间的比例，包装蛋白 4、感染宿主菌：选择合适的宿主菌，LE392, NM538, NM539, KW251等 5、基因组文库的保存和扩增： 6、测滴度，要在106fu以上
7、保存：氯仿4℃，7% DMSO -70℃
需要注意：
(1)电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。
(2)电泳以后，应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间，否则会显著降低克隆效率。
(3)回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。
方法
1。将50μl BAC转化菌的培养物接种到500ml含12。5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃ 震荡(280rpm)培养12到16小时。
2。2500g，4℃，离心15min，收集菌体。
3。用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀。按步骤2方法离心收集细菌。
4。用24ml含RNase(100μg/ml)的碱性裂解液I溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为1mg/ml。
5。加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II。盖紧离心瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，冰裕5min。
6。加入24ml冰预冷的碱性裂解液III，盖紧瓶盖，轻轻翻转瓶子数次，使内容物完全混匀，置冰上5min。
7。15000g，4℃，离心10min，将上清转移到另一离心瓶中，弃沉淀。
8。加等体积的酚：氯仿。轻轻翻转离心瓶数次，混匀。3000g，室温离心15min。
9。将水相移至另一离心瓶中，加入等体积的异丙醇，翻转离心瓶数次，混匀。
10。15，000g，室温离心15分钟，回收核酸沉淀。
11。弃上清，用20ml 70%乙醇漂洗沉淀。
12。弃乙醇，风干使乙醇挥发殆尽。
13。小心将BAC DNA沉淀溶于0。2ml TE (pH8。0) 中。

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